實(shí)驗(yàn)案例
2020/12/21 12:03:21
提取組織器官RNA|凈信多樣品組織勻漿機(jī)實(shí)驗(yàn)案例
來(lái)源：上海凈信
組織樣品中RNA的提取實(shí)驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)的組織樣品主要有小鼠的各個(gè)組織器官（如肝臟，肌肉，脂肪等）和人腫瘤標(biāo)本（如結(jié)直腸癌，肺癌，乳腺癌）
1.首先要根據(jù)需要抽提的組織樣品的質(zhì)量加入相應(yīng)的TRIZOL液體，同時(shí)加入若干顆不銹鋼柱。本實(shí)驗(yàn)室一般情況如下：（小鼠組織加入TRIZOL,結(jié)直腸癌標(biāo)本加入TRIZOL）
注意：
a.用凈信勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理時(shí)樣品體積最好不要超過(guò)TRIzol體積10℅）
b.需事先預(yù)冷試管座
2.把加入樣品,TRIZOL,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預(yù)冷好的試管座中。機(jī)器設(shè)置好參數(shù)蓋上蓋子，點(diǎn)擊運(yùn)行
3.機(jī)器運(yùn)行完畢后，打開蓋子，拿出凈信EP管仔細(xì)觀察組織的研磨情況，如果沒(méi)有明顯的塊狀物，那就可以進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)步驟，如果沒(méi)有完全打碎，還需要把EP管放入試管座中，繼續(xù)勻漿。有些堅(jiān)硬，或者脂肪含量高的組織（乳腺）可能需要稍微長(zhǎng)一點(diǎn)的時(shí)間，時(shí)間可以依據(jù)組織實(shí)際的研磨情況來(lái)調(diào)整勻漿時(shí)間。
4.和傳統(tǒng)的TRIZOL提取RNA的方法一樣,將勻漿樣品在室溫放置幾分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。
5.每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩若干秒，室溫放置幾分鐘。
6.2-8℃10000×g離心十幾分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。
7.把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入異丙醇，室溫放置幾分鐘。
8.2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。
9.用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過(guò)7500×g離心幾分鐘，棄上清。
10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥，過(guò)于干燥會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入無(wú)RNase的水,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應(yīng),勿使用SDS溶液。
常見問(wèn)題分析：
1得率低：
A.樣品裂解或勻漿處理不徹底
B.RNA沉淀未完全溶解
C.檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品沒(méi)有溶于水，而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高
D．樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少
E．勻漿樣品時(shí)未在室溫放置幾分鐘
F．吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相
2 RNA降解
A.組織取出后沒(méi)有馬上處理或冷凍
B.待提取RNA的樣品沒(méi)有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.細(xì)胞在用胰酶處理時(shí)過(guò)度
D.溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理
E.電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.5
3 DNA污染:
A.樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少
B.樣品中含有有機(jī)溶劑(如乙醇,DMSO等),強(qiáng)緩沖液或堿性溶液
預(yù)防RNase污染注意事項(xiàng)：
1．經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細(xì)菌，霉菌可能成為RNase的來(lái)源。
2．使用滅過(guò)菌的RNA專用塑料制品避免交叉污染。
3．RNA在TRIzol試劑中時(shí)不會(huì)被RNase污染，但提取后繼續(xù)處理過(guò)程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
4．配制溶液應(yīng)使用無(wú)RNase的水
本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)研磨的各個(gè)組織中發(fā)現(xiàn)肝臟組織是最容易研磨，研磨效率是最好的。
下圖A是RNA經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的液氮研磨和勻漿器研磨法抽出的RNA跑膠圖，結(jié)果很明顯發(fā)現(xiàn)這種方法是可行的，是可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的方法的。
下圖B是利用組織勻漿器對(duì)小鼠的各個(gè)組織進(jìn)行勻漿抽出的RNA跑膠圖。發(fā)現(xiàn)在抽提各個(gè)組織的RNA的時(shí)候也是可行的。
圖C是利用組織勻漿器對(duì)人結(jié)腸癌標(biāo)本進(jìn)行了研磨后抽提出的RNA的跑膠圖。
圖D是小鼠的肝臟組織經(jīng)過(guò)手工研磨和機(jī)器勻漿后，最后抽提得到的RNA進(jìn)行了濃度的測(cè)定，結(jié)果說(shuō)明組織勻漿器抽提出得RNA的濃度要顯著高于傳統(tǒng)的手工的方法得到的RNA。
蛋白質(zhì)的提取
A.根據(jù)需要抽提的組織樣品的質(zhì)量加入相應(yīng)的蛋白質(zhì)裂解液（如RIPA），同時(shí)加入3顆不銹鋼柱。（小鼠肝臟組織加入1mlRIPA蛋白裂解液，人結(jié)直腸癌組織加入500ulRIPA蛋白裂解液）
B.把加入樣品,蛋白裂解液,不銹鋼柱的Axygene EP管放入事先預(yù)冷好的試管座中。機(jī)器設(shè)置好參數(shù)蓋上蓋子，點(diǎn)擊運(yùn)行。
以下同上RNA的操作方法
最終所得到的蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定經(jīng)過(guò)BCA試劑盒測(cè)定完成的，同時(shí)通過(guò)SDS-PAGE后經(jīng)過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色和western blot檢測(cè)都發(fā)現(xiàn)其要比傳統(tǒng)的方法更加簡(jiǎn)便快捷，不容易引起交叉污染。
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